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G418原理及篩選方法
酷爾化學 / 2018-03-21

G418

原理及篩選方法

原理

 

        

分析轉化的功能和表達需要

DNA

穩定轉染至宿主細胞染色體。外源基因進入細胞后,

部分能夠通過細胞質進入細胞核內,根據細胞類型,至多

80%

的進入核內的外源

DNA

得到

瞬時表達。極少數情況下,進入細胞的外源

DNA

通過系列非同源性分子間重組核連接,最

終整合進細胞染色體。

細胞基因組自由部分表達,

所以整合并不一定意味著表達,

只有整合

到表達區的基因才會表達,而且整合到不同的染色體區段的外源基因的表達的量也是不同

的。由于攝取、整合、表達外源基因是小概率事件,通常根據新表型篩選穩定轉染體。一般

情況下這種新表型由共轉染的編碼抗生素抗性基因提供。

細菌

Tn5 

轉座子序列

neo

抗性基

因)攜帶的氨基糖苷磷酸轉移酶可以將

G418

轉變成無毒形式。

  

        G418 

是一種氨基糖類抗生素,其結構與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似,它通過影

80S

核糖體功能而阻斷蛋白質合成,對原核和真核等細胞都有毒性,包括細菌、酵母、

植物和哺乳動物細胞,

也包括原生動物和蠕蟲。

是穩定轉染最常用的選擇試劑。

neo

基因

被整合進真核細胞基因組合適的地方后,則能啟動

neo

基因編碼的序列轉錄為

mRNA

,從

而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達,

使細胞獲得抗性而能在含有

G418

的選擇

性培養基中生長。

G418

的這一選擇特性,已在基因轉移、基因敲除、抗性篩選以及轉基因

動物等方面得以廣泛應用。

   

        

在進行轉染時細胞膜受到影響,抗生素可能對細胞產生較大影響,加上

G418

有殺菌作

用,所以有人主張轉染時不加其它抗生素。其實

G418

本身有很好的殺菌效果,在用

G418

進行篩選的過程中很少會發生污染。

但有一點,其實我覺得問題也不是很大,那就是:

在老

外的一本實驗手冊中提到,

在脂質體轉染時所用培養基中最好不加任何抗生素。

我想他的想

法可能是脂質體對細胞膜有影響,

可能此時加抗生素對細胞損傷較大。

因為慶大霉素、

鏈霉

素、

G418

均是氨基糖甙類藥物,其藥理作用完全一樣。所以沒有必要再用,而且由于另外

抗生素的添加實際增加氨基糖甙類藥物的濃度,劑量有誤差,不利于各實驗室之間的交流,

在實際操作中,培養液中有抗生素對細胞培養與篩選影響不大。

 

有人認為用磷酸鈣共沉淀轉染法篩選穩定整合子較好,

但這種觀點是很多年以前的觀點

了,而且只是少數人的觀點。我兩種方法都用過,但沒有特異的比較過,感覺都可以。磷酸

鈣便宜,但對溶液配置和實驗操作要求很高,尤其是溶液的

pH

值,要求精確到小數點后

2

位。

脂質體是現在主流的轉染試劑,

從沒有人說這種方法做整合穩定表達不行。

非脂質體是

這幾年發展很快的技術,轉染效率低,細胞毒性小,價格也不貴,

Qiagen

就有一個系列。

我個人覺得不必要花太多時間在這方面,

自己實驗室用得好的技術可以堅持,

沒有經驗的可

以選擇一個較著名的公司的產品開始,

購買之前先下載個說明書看看。

有精力就比較一下幾

種方法,一般的達到目的就行了。關鍵是實驗設計。

  

                                                          ----------

主要參考《細胞培養和分子細胞學技術》和《分子

克隆》

  

G418

篩選實驗設計

   

篩選之前

 

        

由于每種細胞對

G418 

的敏感性不同,

一般變動在

100ug/ml~1000ug/ml

范圍。

而且不同

的廠家生產的相同濃度的

G418

的活性不盡相同,所以在篩選之前,一定要確定你的細胞對

這一批

G418

的最佳篩選濃度。

盡管如此,

特性明確的細胞系

G418 

的最佳用量還是穩定的。

《分子克隆》給出了幾個常用細胞系所需

G418 

的最佳用量。

         

 

細胞系或機體

  G418

濃度(

ug/ml

    

中國倉鼠卵巢細胞

  700~800    

Madin-Darby

犬腎細胞

  500 

G418

原理及篩選方法

 

原理

 

        

分析轉化的功能和表達需要

DNA

穩定轉染至宿主細胞染色體。外源基因進入細胞后,

部分能夠通過細胞質進入細胞核內,根據細胞類型,至多

80%

的進入核內的外源

DNA

得到

瞬時表達。極少數情況下,進入細胞的外源

DNA

通過系列非同源性分子間重組核連接,最

終整合進細胞染色體。

細胞基因組自由部分表達,

所以整合并不一定意味著表達,

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